DNase I（RNase-free）
● 產(chǎn)品組成：
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貨號(hào)
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名稱(chēng)
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規(guī)格
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RTT2104-01
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DNase
I （RNase-free） 1 U/μl
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200 U
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RTT2104-02
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10×DNase
Reaction Buffer
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0.2 ml
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RTT2104-03
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10×EDTA終止液（25
mM）
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0.2 ml
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-
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RNase-free水
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1 ml
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● 保存： -20℃貯存，有效期一年。
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
DNase I，即Deoxyribonuclease
I，中文名稱(chēng)為脫氧核糖核酸酶I，是一種可以消化單鏈或雙鏈DNA產(chǎn)生單脫氧核苷酸或單鏈或雙鏈的寡脫氧核苷酸的核酸內(nèi)切酶。DNase
I水解單鏈或雙鏈DNA后的產(chǎn)物，5'端為磷酸基團(tuán)，3'端為羥基。 DNase I活性依賴于鈣離子，并能被鎂離子或二價(jià)錳離子激活。鎂離子存在條件下，
DNase I可隨機(jī)剪切雙鏈DNA的任意位點(diǎn)；二價(jià)錳離子存在條件下，DNase
I 可在同一位點(diǎn)剪切DNA雙鏈，形成平末端，或1-2個(gè)核苷酸突出的粘末端。該DNase I不含RNase
(RNase free)，可以用于各種RNA樣品的處理。提供了用于DNase I失活所需的EDTA。
用途：制備不含DNA的RNA樣品；RT-PCR反應(yīng)前RNA樣品中去除基因組DNA等可能的DNA污染；體外T7, T3, SP6等RNA
Polymerases催化的RNA轉(zhuǎn)錄后去除DNA模板；DNase
I footprinting研究DNA-蛋白質(zhì)相互作用；缺口平移(nick
translatioin)；產(chǎn)生DNA隨機(jī)片段文庫(kù)；細(xì)胞凋亡TUNEL檢測(cè)中部分剪切基因組DNA作為陽(yáng)性對(duì)照。
● 活性定義：
One unit of
the enzyme completely degrades 1 μg of DNA in 10 min at37°C.
● DNaseI貯存緩沖液：
50mM
Tris-acetate (pH7.5)，10mM CaCl2，50% (v/v) glycerol
10×DNase Reaction Buffer：100m M Tris-HCl (pH7.5 at 25oC)，25mM MgCl2，1mM CaCl2
● DNaseI失活或抑制：
加入EDTA至終濃度為2.5mM后，65℃加熱10分鐘可使DNase I失活。酚氯仿抽提也可以使DNase I失活。金屬離子螯合劑，達(dá)到毫摩爾/升濃度的鋅離子，0.1%的SDS，DTT、巰基乙醇等還原劑，50-100mM以上鹽濃度均對(duì)DNase I有顯著抑制作用。
● 使用方法：
一 RT-PCR反應(yīng)前RNA樣品中DNA的去除：
1.在RNase-free離心管中加入以下溶液：
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組份
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10μl反應(yīng)體系
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備注
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RNA溶液
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1-3
μg
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RNA加入體積小于8
μl
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10×DNase Reaction
Buffer
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1
μl
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DNase I (RNase-free) 1 U/μl
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1
μl
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RNase-free水
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補(bǔ)至10μl
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輕柔混勻
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2.
37oC
孵育
30 分鐘。
3.
向上述反應(yīng)體系中加入
1μl 10×EDTA終止液，65oC
孵育
10 分鐘以失活
DNase I。
注：在沒(méi)有鏊合劑如
EDTA存在情況下加熱，RNA
可被水解。
4.
RNA樣品即可直接用作RT-PCR反應(yīng)的模板。
二 體外RNA反轉(zhuǎn)錄后模板DNA的去除：
1. 在每含有0.5 μg模板DNA的反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系中加入1U DNase I。
注：在某些情況下，模板DNA完全消化所需的DNase的量需通過(guò)實(shí)驗(yàn)進(jìn)行摸索。
2. 37oC
孵育15分鐘。
3. 酚/氯仿抽提失活DNase I。
三 體外RNA反轉(zhuǎn)錄后模板DNA的去除：
1. 參考如下表格設(shè)置反應(yīng)體系：
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組份
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體積
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10×Reaction
Buffer for DNA Polymerase I
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2.5
μl
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3
dNTP Mixture (1mM each, without the
labeled dNTP) *
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1.25
μl
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[α-32P]-dNTP,
~110TBq/mmol (3000Ci/mmol)
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1.85-3.7MBq
(50-100μCi)
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DNase
I (freshly diluted to 0.002U/μl)**
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1
μl
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DNA
Polymerase I, E.coli
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0.
5-1.5 μl (5-15 U)
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Template
DNA
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0.25μg
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RNase-free水
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至25μl
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*3
dNTP Mixture (1mM each, without the
labeled dNTP)：分別取不含已經(jīng)標(biāo)記的 dNTP 外的 3 種 dNTP(100mM) 各 1μl 加入到 97 μl 的RNase-free水中混勻即可。例如標(biāo)記的為
dATP，則需混合
dTTP、dCTP
和
dGTP 三種
dNTP 至每種的最終濃度為
1 mM。配制好的
dNTP 可存放于-20oC
以備后續(xù)使用。
**DNase
I 可以用
1X Reaction Buffer for DNA Polymerase I 進(jìn)行稀釋。
10×Reaction
Buffer for DNA Polymerase I：500mM Tris-HCl (pH7.5 at 25oC)，100mM
MgCl2，10mM DTT。
2.
立即
15oC 孵育
15~60 分鐘。
3.
上述反應(yīng)體系中加入1
μl of 0.5M EDTA(pH 8.0)終止反應(yīng)。
4.
從中取出少量例如1
μl 檢測(cè)標(biāo)記效率。通常標(biāo)記效率至少可以達(dá)到
108cpm/μg DNA。