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Hoechst 33258染色液

Hoechst 33258染色液

產(chǎn)品編號(hào):HE1012S

產(chǎn)品規(guī)格:10ml

數(shù)量
價(jià)格 ¥150

Hoechst 33258染色液(Hoechst Stain Solution,10 μg/ml

●  產(chǎn)品組成:

組分貨號(hào)

名稱

規(guī)格

貯存

HE1012S

Hoechst染色溶液

10 ml

-20

 

說(shuō)明書(shū)

一份

 

● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介:

Hoechst 33258也稱bisBenzimide H 33258或HOE 33258,分子式為C25H24N6O·3HCl,分子量為533.88,CAS Number 23491-45-4。Hoechst 33258是一種可以穿透細(xì)胞膜的藍(lán)色熒光染料,對(duì)細(xì)胞的毒性較低,常用于細(xì)胞凋亡檢測(cè),染色后可用熒光顯微鏡觀察或流式細(xì)胞儀檢測(cè)。Hoechst 33258也用于普通的細(xì)胞核染色、DNA染色。

Hoechst 33258和Hoechst 33342相比,Hoechst 33342對(duì)細(xì)胞的毒性作用更小一些,33258穿透能力較33342弱,染活細(xì)胞時(shí)容易被"泵出",也就是拒染。所以一般來(lái)說(shuō)Hoechst 33258用于細(xì)胞固定后再染色,而Hoechst33342則可以對(duì)活細(xì)胞直接進(jìn)行染色。

Hoechst 33258的最大激發(fā)波長(zhǎng)為346nm,最大發(fā)射波長(zhǎng)為460nm,Hoechst 33258和雙鏈DNA結(jié)合后,最大激發(fā)波長(zhǎng)為352nm, 最大發(fā)射波長(zhǎng)為461nm。

本Hoechst 33258染色液為即用型,可直接用于固定細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色,也可直接用于活細(xì)胞或組織的細(xì)胞核染色

● 貯存:

-20℃避光保存,一年有效。

● 操作步驟:

.固定后的細(xì)胞樣品染色:

1. 貼壁細(xì)胞:

1.1.1 取潔凈蓋玻片在70%乙醇中浸泡5分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間,無(wú)菌超凈臺(tái)內(nèi)吹干或用無(wú)菌的PBS洗滌三遍,再用細(xì)胞培養(yǎng)液洗滌一遍。將蓋玻片置于六孔板內(nèi),種入細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)夜,生長(zhǎng)至50%-80%滿度。

1.1.2刺激細(xì)胞發(fā)生凋亡后,吸盡培養(yǎng)液,加入0.5 ml固定液,固定10分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間(可4℃過(guò)夜)。

1.1.3去盡固定液,用PBS洗兩遍,每次3分鐘,吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床或手動(dòng)晃動(dòng)。

1.1.4加入0.5 ml Hoechst 33258染色液,37℃避光染色10-15分鐘,手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。

1.1.5去盡染色液,用PBS洗兩遍,每次3分鐘,吸盡液體。洗滌時(shí)宜用搖床或手動(dòng)晃動(dòng)。

1.1.6滴一滴抗熒光淬滅封片液于載玻片上,蓋上貼有細(xì)胞的蓋玻片,讓細(xì)胞接觸封片液,盡量避免氣泡。

1.1.7 熒光顯微鏡使用紫外激發(fā),可檢測(cè)到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長(zhǎng)350nm左右,發(fā)射波長(zhǎng)460nm左右。

注:熒光染料都存在淬滅的問(wèn)題,建議染色后盡快檢測(cè)。

2.懸浮細(xì)胞:

1.2.1 500 g(2400 rpm,下同)離心收集凋亡處理后細(xì)胞樣品于1.5 ml離心管內(nèi),加入0.5 ml固定液,緩緩懸起細(xì)胞,常溫固定10分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間(可4℃過(guò)夜)。

1.2.2離心去盡固定液,用PBS洗兩遍,每次3分鐘,洗滌期間手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。

1.2.3 細(xì)胞沉淀中加入0.5 ml Hoechst 33258染色液,37℃避光染色10-15分鐘,手動(dòng)晃動(dòng)數(shù)次。

1.2.4 離心收集沉淀,重懸于100 μl PBS中。

1.2.5 取5 μl抗熒光淬滅封片液于載玻片上,加入等體積步驟1.2.4染色后細(xì)胞重懸液,蓋上一潔凈的蓋玻片,盡量避免氣泡。

1.2.6 熒光顯微鏡下紫外激發(fā),可檢測(cè)到呈藍(lán)色的細(xì)胞核。激發(fā)波長(zhǎng)350 nm左右,發(fā)射波長(zhǎng)460 nm左右。

注:熒光染料都存在淬滅的問(wèn)題,建議染色后盡快檢測(cè)。

.活細(xì)胞染色:

2.1 加入適當(dāng)量Hoechst33258染色液,必須充分覆蓋住待染色的樣品,通常對(duì)于六孔板一個(gè)孔需加入1ml染色液,對(duì)于96孔板一個(gè)孔需加入100微升染色液。

2.2 在適宜于細(xì)胞培養(yǎng)的溫度下培養(yǎng)20-30分鐘。棄染色液,用PBS洗滌2-3次即可進(jìn)行熒光檢測(cè)。細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí),在熒光顯微鏡下觀察會(huì)看到凋亡細(xì)胞的細(xì)胞核呈致密濃染,或呈碎塊狀致密濃染。

. 實(shí)驗(yàn)示例:


操作流程: 胰酶消化液消化,計(jì)數(shù)2×106/ml;500 g 3 min收集1.3 ml 293細(xì)胞;細(xì)胞沉淀中加入1 ml卡諾固定液,常溫固定10 min;1×PBS漂洗兩次;細(xì)胞沉淀中加入200 μl Hoechst染色液(10 μg/ml;37度避光染色10 min; 離心后細(xì)胞沉淀重懸于100 μl 1×PBS中;取5 μl細(xì)胞懸液滴于載玻片上,加5 μl 抗熒光淬滅劑,封片觀察。


 
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